Browsing tag: dermatofity

ZASTOSOWANIE TECHNIKI MALDI-TOF MS DO IDENTYFIKACJI DERMATOFITÓW

APPLICATION OF THE MALDI-TOF MS TECHNIQUE FOR IDENTIFICATION OF DERMATOPHYTES
S. Gnat, D. Łagowski, A. Nowakiewicz

PDF

Streszczenie: Metoda MALDI-TOF MS jest nowym i coraz częściej wykorzystywanym w laboratoriach klinicznych narzędziem do identyfikacji drobnoustrojów. Szerokie zainteresowanie tą metodą wynika z jej wysokiej dokładności, szybkości uzyskiwania wyników identyfikacji mikroorganizmów oraz stosunkowo niskiego kosztu analiz. Implementacja tej techniki do identyfikacji dermatofitów jest jednak trudna. Trudności te spowodowane są naturalną złożonością biologiczną grzybów strzępkowych, bardzo wolnym tempem wzrostu drobnoustrojów i częstym wytwarzaniem pigmentów. Ponadto, identyfikacja dermatofitów tą techniką stanowi wyzwanie ze względu na brak jasnej definicji gatunku dla niektórych taksonów lub w obrębie niektórych kompleksów gatunkowych. Przegląd literatury naukowej wskazuje, że wiarygodność identyfikacji dermatofitów opartej na MALDI-TOF MS waha się między 13,5 a 100%. Liczne czynniki krytyczne związane z rutynowymi procedurami laboratoryjnymi, tj. rodzajem podłoża hodowlanego, czasem inkubacji, techniką ekstrakcji białek, typem urządzenia czy wersją biblioteki widm referencyjnych, warunkują taką zmienność w uzyskiwanych wynikach. Pomimo wielu ograniczeń metoda MALDI-TOF MS stanowi istotny postęp techniczny w diagnostyce mykologicznej i alternatywę dla czasochłonnej i pracochłonnej identyfikacji dermatofitów opartej o cechy morfologiczne oraz sekwencjonowanie DNA. Niemniej jednak zanim zostanie wdrożona do rutynowych badań diagnostycznych, konieczne jest rozszerzenie biblioteki widm referencyjnych dermatofitów, a także opracowanie procedur analizy bezpośredniej z próbek dermatologicznych.
1. Wprowadzenie. 
2. Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem metody MALDI-TOF MS. 3. MALDI TOF MS w diagnostyce mykologicznej. 4. Czynniki krytyczne identyfikacji dermatofitów metodą MALDI-TOF. 4.1. Wpływ stosowanego podłoża mikrobiologicznego. 4.2. Wpływ czasu inkubacji. 4.3. Wpływ procedury ekstrakcji białek i przygotowania matrycy. 4.4. Wpływ stosowanych urządzeń do spektrometrii masowej. 4.5. Wpływ biblioteki widm referencyjnych. 4.6. Wpływ algorytmu porównywania widm. 4.7. Wpływ zmian taksonomicznych. 5. Perspektywy rozwoju MALDI-TOF MS w diagnostyce mykologicznej. 6. Podsumowanie


Abstract: The MALDI-TOF MS method is a new technique, which is being increasingly used in clinical laboratories for identification of microorganisms. The wide interest in this method has been aroused by its high accuracy, instantaneous identification results, and relatively low cost of analyses. However, the application of this technique for identification of dermatophytes poses difficulties. They are caused by the natural biological complexity of filamentous fungi, very slow growth of cultures, and frequent production of pigments. Furthermore, identification of dermatophytes with this technique is a challenge due to the lack of a clear species definition for some taxa or within certain species complexes. A review of scientific literature indicates that the reliability of identification of dermatophytes based on MALDI-TOF MS is in the range between 13.5 and 100%. This variability is determined by many critical factors associated with routine laboratory procedures, i.e. the type of culture medium, incubation time, protein extraction technique, type of device, or version of the reference spectrum library. Despite these numerous limitations, the MALDI-TOF MS method is part of the significant technical progress in mycological diagnostics and an alternative to the time-consuming and labor-intensive identification of dermatophytes based on morphological traits and DNA sequencing. Nevertheless, before the technique can be implemented into routine diagnostic tests, it is necessary to expand the reference spectra library and develop procedures for direct analysis of dermatological samples.
1. Introduction. 2. Identification of microorganisms using the MALDI-TOF MS method. 3. MALDI TOF MS in mycological identification. 4. Critical factors in identification of dermatophytes with the MALDI-TOF method. 4.1. Impact of the microbiological medium. 4.2. Impact of the incubation time. 4.3. Impact of the protein extraction procedure and preparation of the matrix. 4.4. Impact of the mass spectrometry apparatus. 4.5. Impact of the reference spectrum library. 4.6. Impact of the spectrum comparison algorithm. 4.7. Impact of taxonomic changes. 5. Prospects for the development of MALDI-TOF MS in mycological diagnostics. 6. Summary

Mechanizmy powstawania oporności dermatofitów na substancje przeciwgrzybicze

Mechanisms of dermatophyte resistance to antifungal substances
D. Łagowski, S. Gnat, A. Nowakiewicz

PDF

Streszczenie: Dermatofity to grzyby chorobotwórcze, które mają wysokie powinowactwo do keratyny obecnej w paznokciach, skórze i włosach, powodujące zakażenia powierzchniowe znane jako grzybice skórne lub dermatomykozy. Rokowania w przebiegu dermatomykoz mogą być różne, a obraz kliniczny choroby w dużym stopniu zależny jest od statusu immunologicznego gospodarza i może mieć postać od ograniczonych zakażeń skórnych lub podskórnych do infekcji inwazyjnych, rozsianych i zagrażających życiu. W pierwszych dziesięcioleciach XX wieku pojawiły się pierwsze obawy związane z narastającą prewalencją infekcji grzybiczych u ludzi, której powodów upatrywano w różnych czynnikach środowiskowych i rozwoju cywilizacyjnym. W konsekwencji zostały podjęte pierwsze próby terapeutyczne ukierunkowane na leczenie tych infekcji. Obecnie lekarze mają do dyspozycji przynajmniej kilka różnych grup leków przeciwgrzybiczych. Niemniej jednak nakładające się mechanizmy działania tych substancji i przerywanie terapii przez pacjentów mogą być przyczyną pojawiania się szczepów wykazujących oporność, także wielolekową. Celem niniejszej pracy jest dokonanie przeglądu literatury traktującej o mechanizmach powstawania oporności wobec substancji przeciwgrzybiczych przez dermatofity. W drodze ewolucji grzyby te wytworzyły złożone układy odpowiedzi immunologicznej obejmujące elementy systemu sygnalizacji środowisko-komórka, reakcje na stresory jak i tolerancje na szkodliwe substancje chemiczne. Ekspozycja dermatofitów na lek przeciwgrzybiczy, uszkodzenie ich ściany komórkowej, zaburzenia osmolarności środowiska i pojawienie się w nim reaktywnych form tlenu stanowią bodźce, które mogą być aktywatorami szlaków sygnałowych, mających na celu przeciwdziałanie skutkom nagłego stresu komórkowego. Większość z mechanizmów molekularnych leżących u podstaw odpowiedzi na te stresory stanowi również mechanizm tolerancji i oporności na substancje przeciwgrzybicze. Poznanie tych mechanizmów może w przyszłości doprowadzić do opracowania nowych chemioterapeutyków, które stanowić będą kluczową strategię w leczeniu opornych na obecnie dostępne leki przeciwgrzybicze szczepów dermatofitów.
1. Wprowadzenie. 2. Obecnie stosowane leki przeciwgrzybicze. 3. Ekspozycja patogenu na lek, reakcja na stres i adaptacja. 4. Mechanizmy wyrzutu leku z komórki. 5. Mechanizmy detoksyfikacji leków. 6. Transkrypcyjna modulacja genów szlaków sygnałowych. 7. Rola białek szoku cieplnego w lekooporności. 8. Mutacje w genach docelowych enzymów wpływające na lekooporność. 9. Elementy strukturalne komórki wpływające na lekooporność. 10. Podsumowanie

 

Abstract: Dermatophytes are pathogenic fungi with high affinity for keratinised structures present in nails, skin, and hair causing superficial
infections known as skin mycoses or dermatomycoses. The disease is characterised by variable prognosis. Its clinical picture is largely depen-
dent on the immune status of the host and can range from local skin or subcutaneous infections to invasive, disseminated, and life-threatening infections. In the first decades of the 20th century, the first concerns were raised about the growing prevalence of fungal infections in
humans, which was ascribed to various environmental factors and anthropopressure. Consequently, the first therapeutic attempts were made
to treat these infections. At present, at least several different groups of antifungal drugs are available for medical treatment. Nevertheless, the overlapping mechanisms of action of these substances and discontinuation of therapy by patients may contribute to the emergence of resistance of strains, including multi-drug resistance. The aim of this study is to review the literature focused on the mechanisms of resistance developed by dermatophytes to antifungal substances. Through evolution, these fungi have developed complex cellular response systems comprising elements of the environment-cell signalling system, responses to stressors, and tolerance to harmful chemical substances.
Such stimuli as exposure of dermatophytes to an antifungal drug, damage to their cell wall, and disturbances in the osmolarity of the
environment with generation of reactive oxygen species can be activators of signalling pathways targeted at mitigation of the effects of
sudden cellular stress. A majority of molecular mechanisms underlying the response to these stressors also constitute a mechanism of tolerance and resistance to antifungal substances. In the future, elucidation of these mechanisms may lead to development of new chemotherapeutics that will become a key strategy in the treatment of dermatophyte strains exhibiting resistance to currently available antifungal drugs.
1. Introduction. 2. Current antifungal drugs. 3. Exposure of the pathogen to drugs, stress response, and adaptation. 4. Mechanisms of drug efflux from the cell. 5. Mechanisms of drug detoxification. 6. Transcriptional modulation of signalling pathway genes. 7. Role of heat shock proteins in drug resistance. 8. Mutations in target enzyme genes inducing drug resistance. 9. Structural elements of the cell contributing to drug resistance. 10. Summary

NOWE SYNTETYCZNE I NATURALNE ANTYMYKOTYKI W KONTEKŚCIE TERAPII DERMATOMYKOZ

CLINICALLY USED AND POTENTIAL ANTIMYCOTICS IN THE CONTEXT OF THERAPY OF DERMATOMYCOSES
Sebastian Gnat, Dominik Łagowski, Aneta Nowakiewicz, Mariusz Dyląg

 PDF

Streszczenie: Paradoksalnie, pomimo postępu w medycynie obserwuje się rosnącą z każdym rokiem prewalencję infekcji grzybiczych. Na początku trzeciego tysiąclecia możliwości terapeutyczne wciąż są bardzo ograniczone. Obecnie w klinicznym użyciu znajduje się zaledwie osiem klas związków przeciwgrzybiczych, z których tylko cztery mają zastosowanie w terapii dermatomykoz. Trwające od drugiej połowy XX wieku intensywne poszukiwania ,,świętego Graala” terapii przeciwgrzybiczej napotykają na poważne przeszkody wynikające z eukariotycznego modelu budowy komórki grzyba. W niniejszej pracy w syntetyczny sposób zostały opisane nowe grupy związków chemicznych pochodzenia głównie naturalnego, które ze względu na przejawianą przez nie aktywność przeciwgrzybiczą, w tym wobec patogennych gatunków dermatofitów, mogą stanowić nowe opcje terapeutyczne. Spośród związków budzących obecnie duże zainteresowanie na uwagę zasługują związki z grupy terpenoidów, alkaloidów, saponin, flawonoidów i olejków eterycznych. Wiele z tych związków znajduje się w fazie badań klinicznych jako potencjalne leki przeciwgrzybicze, podczas gdy inne są na etapie badań przedklinicznych. Przyszłe badania powinny być skupione na próbie określenia możliwości aplikacyjnych danych substancji w implementacji do rutynowego stosowania oraz ich skuteczności, toksyczności i powodowanych działań niepożądanych.

1. Wprowadzenie. 2. Ogólna charakterystyka dermatofitów w aspekcie terapeutycznym. 3. Nowe syntetyczne preparaty o działaniu przeciwgrzybiczym. 4. Naturalne preparaty przeciwgrzybicze. 4.1. Terpenoidy i olejki eteryczne. 4.2. Alkaloidy. 4.3. Flawonoidy. 4.4. Saponiny.
4.5. Inne związki chemiczne 5. Podsumowanie

Abstract: Paradoxically, despite the progress in medicine, the prevalence of fungal infections is increasing from year to year. At the beginning of the third millennium, practical therapeutic options are still very limited. Currently, only eight classes of antifungal compounds are in clinical use, only four of which are used in the treatment of dermatomycoses. The intense search for the “Holy Grail” of antifungal therapy that has been going on since the second half of the 20th century faces serious obstacles arising from the eukaryotic model of fungal cell structure. In this paper, new groups of chemical compounds of mainly natural origin have been synthetically described, which due to their interesting antifungal activity, including pathogenic species of dermatophytes, may constitute new therapeutic options. Among compounds currently arousing great interest, compounds from the group of terpenoids, alkaloids, saponins, flavonoids and essential oils deserve attention. Many of these compounds are in clinical trials as potential antifungal agents, while others are in preclinical studies. Future research should focus on attempting to determine the applicability of the given substances in implementation for routine use and their effectiveness, toxicity and side effects.

1. Introduction. 2. General characteristics of dermatophytes in the therapeutic aspect. 3. New synthetic preparations with antifungal activity. 4. Natural antifungal preparations. 4.1. Terpenoids and essential oils. 4.2. Alkaloids. 4.3. Flavonoids. 4.4. Saponins. 4.5. Other chemical compounds 5. Summary

MOLEKULARNE METODY DIAGNOSTYKI DERMATOMYKOZ – PRZEGLĄD DOSTĘPNYCH TECHNIK ORAZ OCENA ICH ZALET I WAD W IMPLEMENTACJI DO RUTYNOWEGO STOSOWANIA

MOLECULAR METHODS FOR DIAGNOSTICS OF DERMATOMYCOSES – REVIEW OF AVAILABLE TECHNIQUES AND EVALUATION OF THEIR ADVANTAGES AND DISADVANTAGES IN IMPLEMENTATION FOR IN ROUTINE USE
Sebastian Gnat, Dominik Łagowski, Aneta Nowakiewicz, Mariusz Dyląg

DOWNLOAD PDF FILE

Streszczenie: Infekcje grzybicze skóry, włosów i paznokci stanowią najliczniejszą i najbardziej rozpowszechnioną grupę wszystkich grzybic. Czynnikami etiologicznymi większości grzybiczych infekcji powierzchownych są dermatofity, które, pomimo że są najstarszymi mikroorganizmami uznanymi za czynniki chorobotwórcze, długo nie doczekały się stabilnego systemu taksonomicznego. Z diagnostycznego punktu widzenia, identyfikacja gatunkowa dermatofitów wciąż stanowi poważny problem w postępowaniu identyfikacyjnym, z czego wynikają częste błędy terapeutyczne. Wzrastająca liczba zakażeń, w tym również odzwierzęcych, brak stabilności taksonomicznej i niejednoznaczny obraz kliniczny wszystkich przypadków dermatomykoz powodują konieczność poszukiwania nowych metod szybkiej, taniej i powtarzalnej identyfikacji gatunkowej tych grzybów. Ostatnia dekada stanowi rewolucyjny czas opracowywania molekularnych metod diagnostyki i identyfikacji gatunkowej czynników etiologicznych powodujących te dermatomykozy. Wyniki wielu badań wskazują, że bezpośrednia identyfikacja grzybów z próbek dermatologicznych w oparciu o metody molekularne jest o wiele bardziej wiarygodna i znacznie szybsza w porównaniu z prowadzoną metodami konwencjonalnymi. Niejednokrotnie, identyfikowano też czynnik etiologiczny obserwowanych zmian, podczas gdy wynik hodowli był negatywny. Poszczególne metody molekularne stosowane w identyfikacji gatunkowej grzybów bezpośrednio z materiału klinicznego różnią się sposobami ekstrakcji DNA genomowego, zastosowanymi technikami PCR, wykorzystywanym markerem molekularnym oraz systemem interpretacji wyników. W niniejszej pracy dokonano przeglądu literatury traktującej o różnych metodach diagnozowania grzybic powierzchniowych opartych o techniki biologii molekularnej, o ich zaletach i ograniczeniach, a także o czynnikach krytycznych dla ich implementacji do rutynowego stosowania. Stanowisko mikrobiologów wydaje się być jednoznaczne, czas, kiedy diagnostyka molekularna zastąpi konwencjonalne techniki oparte na hodowli dermatofitów i ocenie ich morfologii, nieubłaganie nadchodzi. Molekularne metody identyfikacji czynników etiologicznych dermatomykoz bezpośrednio z próbek dermatologicznych są zdecydowanie bardziej atrakcyjne i mają wiele zalet.

1. Wprowadzenie. 2. Znaczenie identyfikacji gatunkowej dermatofitów w próbkach dermatologicznych. 3. Molekularna identyfikacja gatunkowa czystych kultur dermatofitów. 4. Metody bezpośredniej identyfikacji grzybów z prób klinicznych. 4.1. Izolacja DNA. 4.2. Techniki bezpośredniej identyfikacji oparte na klasycznym PCR. 4.3. Techniki bezpośredniej identyfikacji oparte na PCR w czasie rzeczywistym. 5. Wybór optymalnej metody do stosowania rutynowego. 6. Zalety i wady molekularnych metod identyfikacyjnych stosowanych w mykologii. 7. Podsumowanie

Abstract: Fungal infections of the skin, hairs, and nails undeniably dominate among all types of fungal infections. The etiological factors of the majority of superficial fungal infections are dermatophytes which, although they are the oldest microorganisms considered as pathogens, have long been unstable in the taxonomic position. From a diagnostic point of view, the species identification of dermatophytes is still a serious problem, often generating therapeutic errors. An increasing number of infections, including zoonoses, lack of taxonomic stability and ambiguous clinical picture of all cases of dermatomycosis induce to search for new, fast, repeatable and at the same time cheap methods of species identification of these fungi. In the last decade, revolutionary progress has been observed in the development of molecular methods for the diagnosis of fungal infections and the reliable identification of species of etiological factors that cause these dermatomycoses. The results of many studies indicate that the direct identification of fungi from dermatological samples based on molecular methods is much more reliable and much faster compared to that carried out by conventional methods. Often, the etiological factor of the observed changes was also identified, while the result of cultivation was negative. Particular molecular methods used in the species identification of fungi directly from the clinical material differ in the procedures of genomic DNA extraction, PCR techniques used, the molecular marker used and the results interpretation system. This paper reviews literature regarding different methods of diagnosing of superficial fungal infections based on molecular biology techniques, their advantages and limitations, as well as critical factors for their implementation for routine use. The position of microbiologists in this matter seems to be a foregone conclusion, the time when molecular diagnostics will replace the conventional techniques, based on the cultivation of dermatophytes and assessing their morphology, inexorably coming. Molecular methods of identifying aetiological factors of dermatomycoses directly from dermatological samples are much more attractive and have many advantages.

1. Introduction. 2. Importance of identification of dermatophyte species in dermatological samples. 3. Molecular species identification in pure dermatophyte cultures. 4. Methods for direct identification of fungi from clinical samples. 4.1. DNA isolation. 4.2. Classical PCR-based techniques of direct identification. 4.3. Real-time PCR-based techniques of direct identification. 5. Choice of an optimal method for routine use. 6. Advantages and drawbacks of molecular identification methods applied in mycology. 7. Summary

TAKSONOMIA DERMATOFITÓW – SYSTEMY KLASYFIKACYJNE ZMIENIAJĄ SIĘ, PROBLEMY IDENTYFIKACYJNE POZOSTAJĄ TE SAME

TAXONOMY OF DERMATOPHYTES – CLASSIFICATION SYSTEMS CHANGE, IDENTIFICATION PROBLEMS REMAIN THE SAME
Sebastian Gnat, Aneta Nowakiewicz, Przemysław Zięba

DOWNLOAD PDF FILE

Streszczenie: Infekcje grzybicze skóry, włosów i paznokci cechuje najwyższa prewalencja wśród wszystkich grzybic dotykając obecnie ponad 20–25% populacji ludzi i zwierząt na świecie. Czynnikami etiologicznymi większości grzybiczych infekcji powierzchniowych są dermatofity. Spośród innych patogennych grzybów strzępkowych wyróżnia je unikalna właściwość rozkładu keratyny. Ogromna zdolność przetrwania w różnych ekosystemach grzybów tej grupy wynika z ich różnorodności morfologicznej, ekologicznej, jak również możliwości adaptacji do zmieniających się warunków środowiska. Dermatofity chociaż stanowią jedna z najstarszych grup mikroorganizmów długo nie doczekały się stabilnego systemu taksonomicznego. Co najważniejsze z klinicznego punktu widzenia, dermatofity wciąż przysparzają problemów diagnostycznych, co skutkuje błędami terapeutycznymi. Rosnąca liczba zakażeń, w tym również odzwierzęcych, brak stabilności taksonomicznej i niejednoznaczny obraz kliniczny niektórych przypadków dermatomykoz powodują konieczność poszukiwania nowych metod szybkiej, taniej i powtarzalnej identyfikacji gatunkowej tych grzybów. Z kolei identyfikacja gatunkowa determinowana jest jasnością kryteriów klasyfikacyjnych uwzględniających poglądy klinicystów, epidemiologów i mykologów. W niniejszej pracy Autorzy przedstawiają ewolucję systemów taksonomicznych dermatofitów na przestrzeni dziejów rozwoju mikrobiologii. Odkrywanie nowych faktów z zakresu biologii i ekologii dermatofitów, jak również rozwój technik możliwych do zastosowania w laboratorium diagnostyki mykologicznej skutkowały opracowaniem nowych strategii identyfikacyjnych. Współczesny system klasyfikacyjny tych patogenów oparty na badaniach molekularnych wydaje się być stabilny i szeroko akceptowany, czy jednak zakończy wiekowe zamieszanie klasyfikacyjne i okres setek zmian nomenklaturowych, będących koszmarem diagnostów? Można wnioskować, że taksonomia dermatofitów, zwłaszcza gatunków antropofilnych, jest już wystarczająco dojrzała, aby ustabilizować się z korzyścią zarówno dla klinicystów, jak i naukowców.

1. Wprowadzenie. 2. Pierwsze systemy klasyfikacji dermatofitów. 3. Fenotypowe systemy klasyfikacyjne. 4. „Biologiczna” era w klasyfikacji. 5. Ekologiczny podział dermatofitów. 6. Molekularna rewolucja w taksonomii dermatofitów. 7. Problemy taksonomiczne w mykologii. 8. Kliniczny aspekt taksonomii dermatofitów. 9. Obecnie obowiązujący system klasyfikacyjny. 10. Nierozróżnialne „kompleksy gatunków”. 11. Podsumowanie

Abstract: Fungal infections of the skin, hair, and nails is characterized by the highest prevalence among all fungal infections currently affecting over 20–25% of the world’s human and animal populations. Dermatophytes are the etiological factors of the most superficial fungal infections. Among other pathogenic filamentous fungi distinguishes them a unique attribute to degrade keratin. The remarkable ability of this group of fungi to survive in different ecosystems results from their morphological and ecological diversity as well as high adaptability to changing environmental conditions. Dermatophytes, although they are one of the oldest groups of microorganisms recognised as pathogens, nevertheless they have not been classified in a stable taxonomic system for a long time. In terms of diagnostics, dermatophytes still pose a serious problem in the identification procedure, which is often related to therapeutic errors. The increasing number of infections including zoonoses, lack of taxonomic stability, and ambiguous clinical picture of dermatomycosis cases necessitate a search for new methods for rapid, cheap, and reproducible species identification of these fungi. In turn, the species identification is determined by the clarity of classification criteria combined with the taxonomic division generally accepted by microbiologists and referring to the views expressed by clinicians, epidemiologists, and scientists. In this paper, the authors present the evolution of taxonomic systems for dermatophytes over the history of microbiology development. Discovery of new facts about the biology and ecology of dermatophytes and the development of techniques applicable applied in a mycological diagnosis laboratory facilitated development of new identification strategies at various points in the history. The modern molecular classification system of these pathogens seems to be stable and widely accepted. However, will it end the long-standing classification confusion and the period of hundreds of nomenclatural changes, which are diagnosticians’ nightmare? It can be argued that the taxonomy of dermatophytes, in particular that of anthropophilic species, is sufficiently established to be stabilised for the benefit of both clinicians and scientists.

1. Introduction. 2. First dermatophyte classification systems. 3. Phenotypic classification systems. 4. “Biological” era in the classification. 5. Ecological division of dermatophytes. 6. Molecular revolution in the taxonomy of dermatophytes. 7. Taxonomic problems in mycology. 8. Clinical aspect of the taxonomy of dermatophytes. 9. Current classification system. 10. Indistinguishable “species complexes”. 11. Summary